東莞石碣白蟻防治中心為您普及：白蟻是一種世界性重要害蟲(chóng)。全世界已知白蟻種類(lèi)有約3000種[1]，我國(guó)約400多種[2]，在長(zhǎng)江以南地區(qū)危害尤為嚴(yán)重。它們與人類(lèi)經(jīng)濟(jì)密切相關(guān)，可對(duì)人類(lèi)社會(huì)造成較大危害[3-4]。早期傳統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)法為白蟻的分類(lèi)鑒定奠定了基礎(chǔ)。白蟻的外部形態(tài)相似，目前白蟻主要依靠兵蟻或有翅成蟲(chóng)進(jìn)行分類(lèi)[5]。但是在區(qū)分一些相似種、近緣種上難度較大，容易引起誤判[6-7]。同時(shí)，白蟻的形態(tài)學(xué)分類(lèi)往往需要一定數(shù)量的個(gè)體，分類(lèi)時(shí)個(gè)體太少則會(huì)影響結(jié)果的可靠性，而有些白蟻種群的兵蟻很少，這都給白蟻的分類(lèi)帶來(lái)了較大的困難。

    基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( Polymerase chainreaction, PCR)技術(shù)為物種鑒定提供了新的手段，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的諸多不足[8]。該技術(shù)通過(guò)引物和模板DNA特異性的結(jié)合, 可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增出數(shù)百萬(wàn)特異DNA序列拷貝。它具有如下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）不受白蟻組織類(lèi)別、發(fā)育階段等影響。DNA上得到的信息不會(huì)隨白蟻發(fā)育時(shí)期的不同而變化。（2）不受環(huán)境影響。因?yàn)榄h(huán)境只影響基因表達(dá)，而不改變基因的核苷酸序列。（3）DNA分子標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、易于自動(dòng)化。（4）提取的DNA樣品，在低溫下可長(zhǎng)期保存[9]。因此，近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于白蟻分類(lèi)研究中。線粒體編碼細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅱ基因（COⅡ）已成為當(dāng)前動(dòng)物分子系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記[10]。Jenkins等首次利用COⅡ基因序列推斷臺(tái)灣乳白蟻入侵危害的途徑[11]。Miura等利用線粒體COⅡ基因和翻譯的蛋白質(zhì)序列對(duì)進(jìn)化較高的白蟻科和鼻白蟻科15個(gè)屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究[12]。

    本研究在廣東省范圍內(nèi)采集白蟻標(biāo)本，并采用基于COⅡ基因部分序列的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法鑒別確認(rèn)白蟻種類(lèi)，該研究可為今后開(kāi)展白蟻種群分布和危害調(diào)查提供科學(xué)基礎(chǔ)，從而進(jìn)一步掌握蟻害發(fā)生特點(diǎn)，提高白蟻防治水平。

2.材料和方法

2.1材料和儀器

2.1.1材料和試劑

    一次性組織研磨棒、1.5mL離心管、200μL PCR薄壁管，1000μL、200μL、10μL槍頭、上下游引物均購(gòu)；Takara r-taq 酶（250U）、Takara DL 2000 DNA marker（500μL）購(gòu)；EasyPure Genomic DNA提取試劑盒、Axygen膠回收試劑盒、Biowest Agarose瓊脂糖（100g）。

2.1.2儀器設(shè)備

    梯度PCR儀、瓊脂糖水平電泳儀、手提紫外分析儀、Fresco 21微型離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、電子分析天平（0.0001g）、全自動(dòng)蒸汽高壓滅菌鍋、移液槍、超級(jí)恒溫水浴鍋。

2.2試驗(yàn)方法

2.2.1白蟻樣本采集

    從全廣東省范圍內(nèi)，特別是白蟻危害重點(diǎn)區(qū)域采集白蟻標(biāo)本。采集白蟻時(shí)，取活體或死亡時(shí)間少于24 h的完整成蟲(chóng)體，密封保存于99.9%酒精的樣本瓶中，做好標(biāo)簽和記錄。

2.2.2白蟻組織基因組DNA提取

    選取白蟻整體為試驗(yàn)材料，用紙巾將樣品表面的酒精和水分吸干后，稱重，控制樣品質(zhì)量≤25 mg。樣品用研磨棒研磨，采用EasyPure Genomic DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA。最后用EB溶液進(jìn)行兩次洗脫，合并兩次的洗脫液用于PCR反應(yīng)的模板。

2.2.3 PCR擴(kuò)增COⅡ基因部分序列

2.2.3.1引物

    通常用于種群分類(lèi)分析的基因是16S rRNA、COI、COII、ND1、ND5[2]。本文采用以下引物用于片段擴(kuò)增：上游引物COⅡ1：5’-CAGATAAGTGCATTGGATTT-3’；下游引物COⅡ2：5’-GTTTAAGAGACCAGTACTTG-3’。

2.2.3.2擴(kuò)增體系

    采用Takara公司生產(chǎn)的PCR試劑盒。反應(yīng)體系50μL，包括：5μL10×buffer(Mg2+-)，4μLdNTP，3μLMg2+,正反引物各1μL(20 mmol/L)，1μLDNA模板，17μL滅菌超純水。

PCR反應(yīng)條件如下：起始94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。最后72℃反應(yīng)10 min。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用EB染色。用DNA marker（DL2000）標(biāo)記擴(kuò)增片段大小，以確定是否為目的片段。電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)觀察。

對(duì)于有雜質(zhì)，需要純化的PCR產(chǎn)物，采用Axygen膠回收試劑盒純化后測(cè)序；對(duì)于擴(kuò)增效果良好的PCR產(chǎn)物則可直接測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)廣東生物資源應(yīng)用研究所進(jìn)行測(cè)序和拼接，每個(gè)樣品采用正反鏈雙向測(cè)序，以提高測(cè)序的準(zhǔn)確度。

2.2.4數(shù)據(jù)分析

    根據(jù)委托公司發(fā)回的測(cè)序結(jié)果，將正反鏈拼接得出的堿基序列在NCBI網(wǎng)站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進(jìn)行BLAST相似性搜索，選擇相似度最高的確定為該物種。

3.結(jié)果與分析

3.1白蟻標(biāo)本采集結(jié)果

    在廣東省范圍內(nèi)，特別是白蟻危害重點(diǎn)區(qū)域共收集有效白蟻標(biāo)本185個(gè)。

3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

    以編號(hào)zj144、zj035、zj115、zj102、zj101、zj100、zj099、zj097、zj095、zj094、 zj093、zj092的樣品為例，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。引物對(duì)檢測(cè)樣本擴(kuò)增出800bp左右的條帶。結(jié)果顯示，檢測(cè)樣本的PCR擴(kuò)增結(jié)果與設(shè)計(jì)目標(biāo)相同；同時(shí)，目標(biāo)條帶明亮清晰，說(shuō)明PCR擴(kuò)增特異性較高，效果良好，PCR產(chǎn)物可直接測(cè)序。

圖1引物PCR擴(kuò)增圖（從左到右條帶分別為DNA marker（DL2000）、zj144、zj035、zj115、 zj102、zj101、 zj100、 zj099、zj097、zj095、zj094、 zj093、 zj092）

3.3 測(cè)序結(jié)果

    以編號(hào)zj004的白蟻標(biāo)本為例，測(cè)序后拼接得出的堿基序列如圖2所示。將堿基序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST相似性搜索，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，zj004號(hào)樣本與臺(tái)灣乳白蟻這一物種的基因相似度最高，相似度達(dá)99%。同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確認(rèn)zj004號(hào)樣本為臺(tái)灣乳白蟻。

圖2 zj004號(hào)白蟻樣本拼接堿基序列

4.總結(jié)與展望

    本研究在廣東省范圍內(nèi)采集白蟻標(biāo)本185份，經(jīng)分子生物學(xué)方法共鑒定出2科4屬7種白蟻。散白蟻所占比例明顯高于其他屬白蟻，其中黑胸散白蟻比例最高，為該地區(qū)優(yōu)勢(shì)蟻種。

    隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行種類(lèi)鑒別、檢測(cè)的應(yīng)用越來(lái)越多[13-14]。本文利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)白蟻種類(lèi)做出鑒別，無(wú)論白蟻何種生物型和蟲(chóng)態(tài)，均可用于鑒定；同時(shí)需要的樣品量少，簡(jiǎn)便快捷，提取的DNA模板可用于多次檢測(cè)。但需要注意的是，要防止昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA降解，才能獲得可靠準(zhǔn)確的遺傳信息。相信隨著研究的不斷深入，實(shí)驗(yàn)技術(shù)將不斷完善和提高。在結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，現(xiàn)代分子生物技術(shù)正成為白蟻分類(lèi)鑒定的有力手段，為進(jìn)一步開(kāi)展白蟻的分布和危害調(diào)查提供更為堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)，并為白蟻防治提供新的方法和思路。

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